Biochemical and functional characterization of protease inhibitors (serpins and kunitz), identified from the sialotranscriptome of Hyalomma dromedarii tick

Doenças cardiovasculares afetam o coração e as artérias sanguíneas, frequentemente surgindo a partir de disfunções relacionadas às plaquetas, desregulação da coagulação sanguínea, ou uma combinação de ambos. As glândulas salivares do carrapato são consideradas uma fonte natural atrativa de compostos antihemostáticos. Sua saliva inclui um coquetel de moléculas bioativas que atuam especificamente nos componentes distintos da coagulação sanguínea. Neste estudo, combinamos métodos computacionais e experimentais para caracterizar três serpinas, aqui chamadas de HDS1, HDS2 e HDS3, do sialotranscriptoma do carrapato do camelo, Hyalomma dromedarii. Nossos dados in silico descreveram essas serpinas como proteínas secretadas com alta semelhança com serpinas inibitórias previamente caracterizadas. As proteínas recombinantes (rHDS1, rHDS2 e rHDS3) foram expressas com sucesso usando o sistema de expressão Escherichia coli BLD21 (DE3). A rHDS1 foi obtida como um monômero bem estruturado e solúvel, enquanto rHDS2 e rHDS3 agregaram-se como corpos de inclusão. Ensaios funcionais revelaram que a rHDS1 prolongou significativamente o tempo de coagulação da via intrínseca, mirando principalmente a trombina (IC50 = 0,16 μM). A rHDS1 também foi capaz de inibir a calicreína, FXIa e um modesto efeito sobre FXIIa, exibindo impacto insignificante em outros fatores de coagulação. A rHDS1 agiu na inibição da agregação plaquetária induzida pela trombina. Por outro lado, a rHDS2 não demonstrou influência significativa no tempo de coagulação. Essas observações sobre a rHDS2 poderiam potencialmente ser atribuídas ao dobramento inadequado da proteína ou, alternativamente, ao seu impacto insignificante na hemostasia. Em conclusão, esta tese fornece insights valiosos sobre os papéis das serpinas nas glândulas salivares do carrapato do camelo. Notavelmente, a rHDS1 se destaca como a primeira serpina recombinante do gênero Hyalomma capaz de inibir a trombina tanto na coagulação sanguínea quanto na agregação plaquetária, possivelmente envolvendo a heparina como cofator. Investigações futuras são necessárias para testar a viabilidade da rHDS1 como um potencial candidato para o desenvolvimento de medicamentos visando doenças potencialmente fatais, como doenças cardíacas e derrames.

Procoagulant State of Sleep Apnea Depends on Systemic Inflammation and Endothelial Damage / El estado procoagulante de la apnea del sueño depende de la inflamación sistémica y el daño endotelial

Introduction. Growing evidence shows a hypercoagulable state in obstructive sleep apnea (OSA) that could be a risk factor for thromboembolic disease. Objectives We aimed to elucidate mechanisms involved in the procoagulant profile observed in patients with OSA and to investigate the potential utility of global tests in its characterization. Methods Thirty-eight patients with severe OSA without previous history of thrombosis and nineteen healthy age- and sex-matched controls were included. Kinetic of clot formation was determined using rotational thromboelastometry. Haemostatic capacity of plasma and microparticles was determined by Calibrated Automated Thrombinography. Platelet surface receptors, activation markers and formation of platelet/leukocytes aggregates were analyzed by flow cytometry. Results Thromboelastometry showed a procoagulant state in patients with OSA that did not seem to be related to a basal activation of platelets but by the increased existence of platelet/leukocyte aggregates. Patients with OSA presented many signs of endothelial damage such as increased plasma levels of E-selectin and cfDNA and enhanced thrombin generation due to the presence of microparticles rich in tissue-factor, which is related to OSA severity. Conclusions OSA induces an enhancement in the dynamics of clot formation which appears to be caused by at least two pathological mechanisms. First, a greater formation of platelet-leukocyte aggregates; secondly, endothelial damage which provokes a greater procoagulant potential due to the increase in tissue factor-rich microparticles. Moreover, this study has identified thromboelastometry and thrombin generation assay as useful tools to evaluate the prothrombotic state in these patients.

Introducción Existen pruebas crecientes que muestran un estado de hipercoagulabilidad en la apnea obstructiva del sueño (AOS) que podría ser un factor de riesgo de desarrollar enfermedad tromboembólica. Objetivos Nuestro objetivo fue dilucidar los mecanismos involucrados en el perfil procoagulante que se ha observado en los pacientes con AOS e investigar la posible utilidad de las pruebas globales en su caracterización. Métodos Se incluyeron 38 pacientes con AOS grave sin antecedentes de trombosis y 19 controles sanos emparejados por edad y sexo. La cinética de la formación del coágulo se determinó mediante tromboelastometría rotacional. La capacidad hemostática del plasma y las micropartículas se determinó mediante trombinografía automatizada calibrada. Los receptores de la membrana plaquetaria, los marcadores de activación plaquetaria y la formación de agregados de plaquetas-leucocitos se analizaron mediante citometría de flujo. Resultados La tromboelastometría mostró un estado procoagulante en pacientes con AOS que no parecía estar relacionado con una activación basal de las plaquetas, sino por el aumento de agregados de plaquetas-leucocitos. Los pacientes con AOS presentaban muchos signos de daño endotelial, como un aumento de los niveles plasmáticos de E-selectina y ADNcf y una mayor generación de trombina debido a la presencia de micropartículas ricas en factor tisular, que se relaciona con la gravedad de la AOS. Conclusiones La AOS induce un aumento de la dinámica de la formación de coágulos que parece estar causada por al menos 2 mecanismos patológicos. Primero, una mayor formación de agregados plaquetas-leucocitos; segundo, el daño endotelial que provoca un mayor potencial procoagulante debido al aumento de micropartículas ricas en factor tisular. Además, este estudio ha identificado la tromboelastometría y el ensayo de generación de trombina como herramientas útiles para evaluar el estado protrombótico en estos pacientes.

Procoagulant State of Sleep Apnea Depends on Systemic Inflammation and Endothelial Damage.

INTRODUCTION: Growing evidence shows a hypercoagulable state in obstructive sleep apnea (OSA) that could be a risk factor for thromboembolic disease. OBJECTIVES: We aimed to elucidate mechanisms involved in the procoagulant profile observed in patients with OSA and to investigate the potential utility of global tests in its characterization. METHODS: Thirty-eight patients with severe OSA without previous history of thrombosis and nineteen healthy age- and sex-matched controls were included. Kinetic of clot formation was determined using rotational thromboelastometry. Haemostatic capacity of plasma and microparticles was determined by Calibrated Automated Thrombinography. Platelet surface receptors, activation markers and formation of platelet/leukocytes aggregates were analyzed by flow cytometry. RESULTS: Thromboelastometry showed a procoagulant state in patients with OSA that did not seem to be related to a basal activation of platelets but by the increased existence of platelet/leukocyte aggregates. Patients with OSA presented many signs of endothelial damage such as increased plasma levels of E-selectin and cfDNA and enhanced thrombin generation due to the presence of microparticles rich in tissue-factor, which is related to OSA severity. CONCLUSIONS: OSA induces an enhancement in the dynamics of clot formation which appears to be caused by at least two pathological mechanisms. First, a greater formation of platelet-leukocyte aggregates; secondly, endothelial damage which provokes a greater procoagulant potential due to the increase in tissue factor-rich microparticles. Moreover, this study has identified thromboelastometry and thrombin generation assay as useful tools to evaluate the prothrombotic state in these patients.

Disfunción en la plasminogénesis en paciente críticamente enfermo con infección polimicrobiana asociado a deficiencia de glicoproteínas / Plasminogenesis disfunction in critical ilness patient with polimicrobial infection associated glycoproteins deficiency / Disfunção da plasminogênese em paciente crítico com infecção polimicrobiana associada a deficiência de glicoproteínas

Resumen: Presentamos el caso clínico de una paciente de 59 años de edad con sepsis por neumonía polimicrobiana con aislamientos virales condicionantes de sobreinfección bacteriana y trombosis. Su escanografía de tórax reportó colapsos posterobasales con atelectasias e infiltrados intersticiales reticulares; evolucionó con deterioro cognitivo relacionado con enfermedad cerebro vascular multiinfarto documentado por tomografía cerebral con emisión de fotón único por medicina nuclear debido a estudios de cráneo normales; ante la evolución neurológica se realizaron estudios de extensión con ecocardiograma Doppler dúplex color transtorácico, el cual fue normal, así como estudio contrastado de cuatro vasos de cuello, Holter de ritmo eléctrico y perfil metabólico completo también normales. Realizamos una revisión en la literatura con miras a brindar entendimiento y evidenciar la relación directa entre síndromes sépticos e infecciones virales con diferentes estados de hipercoagulabilidad, inflamación y apoptosis.

Abstract: We present the clinical case of a 59-year-old patient with sepsis due to polymicrobial pneumonia with viral isolates conditioning bacterial infection and thrombosis. His chest scannography reported basals collapses with atelectasis and reticular interstitial infiltrates; Evolved with cognitive impairment related to multi-infarction vascular brain disease documented by single-photon emission brain tomography by nuclear medicine due to normal scannographies studies; Given the neurological evolution, extension studies were carried with transthoracic duplex Doppler echocardiogram which was normal, as well as a contrasted study of four neck vessels, electrical rhythm holter and complete metabolic profile also normal. We conducted a review in the literature with a view to providing understanding and evidence of the direct relationship between septic syndromes and viral infections with different states of hypercoagulability, inflammation and apoptosis.

Resumo: Apresentamos o caso clínico de um paciente de 59 anos com sepse por pneumonia polimicrobiana com isolados virais condicionando superinfecção bacteriana e trombose. Sua cintilografia de tórax relatou colapsos póstero-basais com atelectasia e infiltrados intersticiais reticulares; Evoluiu com deterioração cognitiva relacionada à doença cerebrovascular multi-infarto documentada por tomografia cerebral com emissão de fóton único pela medicina nuclear devido a estudos de crânio normais; dada a evolução neurológica, realizaram-se estudos de extensão com ecocardiograma Doppler colorido transtorácico duplex, que foi normal, bem como estudo contrastado de quatro vasos do pescoço, Holter de ritmo elétrico e perfil metabólico completo, também normais. Realizamos uma revisão da literatura com o objetivo de compreender e evidenciar a relação direta entre síndromes sépticas e infecções virais com diferentes estados de hipercoagulabilidade, inflamação e apoptose.

Comparación del potencial de generación de trombina en puerperios de parto con puerperios de cesárea. Resultados preliminares

Resumen: Introducción: El embarazo es un estado asociado con profundos cambios en el sistema hemostático determinando un estado de hipercoagulabilidad relacionado con un aumento en generación de trombina, y como tal, un factor de riesgo bien establecido de Enfermedad Tromboembólica Venosa. El objetivo del presente trabajo es determinar y comparar la generación de trombina en los puerperios de parto con puerperios cesáreas. Evaluar el potencial de generación de trombina como un factor de riesgo adicional para decidir la indicación tromboprofilaxis. Metodología: Estudio analítico observacional prospectivo realizado en el Hospital Pereira Rossell, octubre de 2018 a agosto del 2019. La medición del potencial endógeno de trombina se realizó en el analizador de coagulación BCS® XP automatizado en el Hospital de Clínicas. Resultados: 220 embarazadas, 70 cesáreas (C) y 150 partos (P). El potencial endogeno de trombina (ETP AUC2) fue menor estadísticamente en el grupo P, valor p < 0,001.La concentración máxima de generación de trombina calculado (ETPB AUC2) fue estadísticamente menor en el grupo P valor p = 0,010. Discusión: Hay una diferencia estadísticamente significativa cuando comparamos los parámetros de ETP AUC2 y ETPB AUC2 de los grupos de partos vs cesárea, siendo menor para partos. Conclusión: Las cesáreas presentan un ETP AUC2, ETPB AUC2 mayor que los partos. Esto permitiría seleccionar pacientes con mayor riesgo de enfermedad tromboembólica venosa. La cesárea se identificó como un evento generador de trombina probablemente asociado al mayor daño endotelial que produce.

Abstract: Introduction: Pregnancy is a state associated with profound changes in the hemostatic system, determining a state of hypercoagulability related to an increase in thrombin generation, and as such, a well-established risk factor for Venous Thromboembolic Disease. The objective of this work is to determine and compare the generation of thrombin in postpartum delivery with postpartum cesarean section. Evaluate the potential for thrombin generation as an additional risk factor to decide the thromboprophylaxis indication. Methodology: Prospective observational analytical study carried out at the Pereira Rossell Hospital, from October 2018 to August 2019. The measurement of the endogenous potential of thrombin was carried out in the automated BCS® XP coagulation analyzer at the Hospital de Clínicas. Results: 220 pregnant women, 70 cesarean sections (C) and 150 deliveries (P). The endogenous thrombin potential (ETP AUC2) was statistically lower in group P, p-value < 0.001. The maximum concentration of thrombin generation calculated (ETPB AUC2) was statistically lower in group P, p-value = 0.010. Discussion: There is a statistically significant difference when we compare the ETP AUC2 and ETPB AUC2 parameters of the delivery vs. cesarean section groups, being lower for deliveries. Conclusion: Caesarean sections have a higher ETP AUC2, ETPB AUC2 than deliveries. This would allow selecting patients with a higher risk of venous thromboembolic disease. Cesarean section was identified as a thrombin-generating event probably associated with the greater endothelial damage it produces.

Resumo: Introdução: A gravidez é um estado associado a profundas alterações no sistema hemostático, determinando um estado de hipercoagulabilidade relacionado ao aumento da geração de trombina e, como tal, um fator de risco bem estabelecido para Doença Tromboembólica Venosa. O objetivo deste trabalho é determinar e comparar a geração de trombina no pós-parto com a cesariana pós-parto. Avaliar o potencial de geração de trombina como fator de risco adicional para decidir a indicação de tromboprofilaxia. Metodologia: Estudo analítico observacional prospectivo realizado no Hospital Pereira Rossell, de outubro de 2018 a agosto de 2019. A medição do potencial endógeno da trombina foi realizada no analisador de coagulação automatizado BCS® XP do Hospital de Clínicas. Resultados: 220 gestantes, 70 cesarianas (C) e 150 partos (P). O potencial endógeno da trombina (ETP AUC2) foi estatisticamente menor no grupo P, valor p < 0,001. A concentração máxima de geração de trombina calculada (ETPB AUC2) foi estatisticamente menor no grupo P, valor p = 0,010. Discussão: Há diferença estatisticamente significativa quando comparamos os parâmetros ETP AUC2 e ETPB AUC2 dos grupos de parto vs. cesariana, sendo menor para partos. Conclusão: As cesarianas têm uma ETP AUC2, ETPB AUC2 mais alta do que os partos. Isso permitiria selecionar pacientes com maior risco de doença tromboembólica venosa. A cesariana foi identificada como evento gerador de trombina, provavelmente associado ao maior dano endotelial que produz.

Hemostatic evaluation of rabbits envenomed with Bothrops alternatus treated with anti-bothropic serum, desmopressin and tranexamin acid / Avaliação hemostática de coelhos envenenados com Bothrops alternatus e tratados com soro antibotrópico, desmopressina e ácido tranexâmico

In Brazil, snakes from the Bothrops genus are responsible for thousands of accidents, and their venoms are mainly composed of proteolytic enzymes. Although the antibothropic serum produced by the Brazilian Institutes is remarkably efficient, more studies are necessary, especially in veterinary medicine. The venom contain enzymes and non-enzymatic proteins that interfere with hemostasis leading to hemorrhage or even thrombosis. Possible treatment associations with known bothropic antivenom were the reason for the development of the present study. The aim of this study was to evaluate hemostasis alterations caused by Bothrops alternatus venom in rabbits followed by treatments with anti-bothropic serum, tranexamic acid and desmopressin. Twenty New Zealand rabbits were distributed into five groups (n=4) that were experimentally envenomed with 150mcg/kg of B. alternatus venom via intramuscular injection and treated as follow: Group 1 (G1) was the positive control and received venom and PBS/BSA; Group 2 (G2) was treated with tranexamic acid; Group 3 (G3) with desmopressin; Group 4 (G4) with tranexamic acid and anti-bothropic serum; and Group 5 (G5) with anti-bothropic serum and desmopressin. Blood samples were collected before venom administration, and one, four, eight and 12 hours after, for Partial activated partial thromboplastin time, Prothrombin Time, Thrombin Time and fibrinogen evaluation. Thrombin generation (TG) test was carried out with a pool of samples from final times (8 and 12h). At the end of 12h, all animals were euthanized and necropsy was conducted. Samples from muscle tissue, heart, lungs and kidney were analyzed. Classic coagulation tests showed no significant differences amongst groups and times. However, TG indicated that the venom causes a hypocoagulability state, which was not reversed by proposed treatments. Histology showed muscle inflammation, hemorrhage and necrosis, as well as hemorrhage in other tissues with no differences amongst groups. B. alternatus envenomation causes hypocoagulability detected by TG assay, but not through classical coagulation tests. The use of tranexamic acid and desmopressin for hemostasis stabilization after inoculation of the venom did not show advantage in coagulation restoration.(AU)

No Brasil, as serpentes do gênero Bothrops são responsáveis por milhares de acidentes, e seus venenos são compostos principalmente de enzimas proteolíticas. Embora o soro antiofídico produzido pelos institutos brasileiros seja notavelmente eficiente, mais estudos são necessários, especialmente na medicina veterinária. O veneno contem enzimas e proteínas não-enzimáticas que interferem com a hemostasia levando a hemorragias ou trombose. A associação de outros tratamentos ao soro antibotrópico foi a razão para o desenvolvimento do presente estudo. O objetivo deste estudo foi avaliar as alterações da hemostasia causadas pelo veneno de Bothrops alternatus em coelhos, após tratamento com soro antibotrópico, ácido tranexâmico e desmopressina. Vinte coelhos da Nova Zelândia foram distribuídos em cinco grupos (n = 4) que foram submetidos a experimentos com 150mcg/kg de veneno de B. alternatus por injeção intramuscular. O Grupo 1 (G1) foi o controle positivo e recebeu veneno e PBS / BSA, enquanto o Grupo 2 (G2) foi tratado com ácido tranexâmico, o Grupo 3 (G3) com desmopressina, o Grupo 4 (G4) com ácido tranexâmico e soro antibotrópico, e o Grupo 5 (G5) com soro antibotrópico e desmopressina. As amostras de sangue foram coletadas antes da administração do veneno, e uma, quatro, oito e 12 horas após os tratamentos para realização de tempo de tromboplastina parcial ativada parcial (TTPa), tempo de protrombina (TP), tempo de trombina (TT) e mensuração de fibrinogênio. Para o ensaio de geração de trombina (TG) foi realizado com um pool de amostras nos tempos finais (8 e 12h). Ao final das 12h, todos os animais foram sacrificados e a necropsia foi realizada. Amostras de tecido muscular, coração, pulmões e rins foram analisadas. Os testes TTPa, TP, TT e fibrinogênio não mostraram diferenças significativas entre os grupos e os tempos. No entanto, o TG indicou que o veneno causa um estado de hipocoagulabilidade, que não foi revertido pelos tratamentos propostos. Na histologia, foram observadas inflamação muscular, hemorragia e necrose, além de hemorragia em outros tecidos, sem diferenças entre os grupos. O envenenamento por B. alternatus causa hipocoagulabilidade detectada mais precocemente pelo teste de geração de trombina. O uso de ácido tranexâmico e desmopressina para estabilização da hemostasia após a inoculação do veneno não mostrou vantagem na restauração da coagulação.(AU)

Coagulación intravascular diseminada / Disseminated intravascular coagulation

Resumen La coagulación intravascular diseminada es un estado alterado de la coagulación secundario a cuadros inflamatorios locales o sistémicos. Se caracteriza por un aumento de la coagulación y una inadecuada fibrinólisis endógena que da como resultado la formación de fibrina intravascular, trombosis microvascular multiorgánica y un excesivo consumo de los factores de coagulación sanguínea, esto desencadena sangrados severos y trombosis, los cuales conducen a falla orgánica y circulatoria como principal manifestación clínica. Este artículo tiene como objetivo realizar una revisión del estado del arte describiendo su definición, etiología, fisiopatología, manifestaciones clínicas y actualidades en su diagnóstico y tratamiento. Para esto, se realizó una búsqueda bibliográfica en PubMed utilizando el término MeSH "Disseminated Intravascular Coagulation", seleccionándose 63 artículos por la relevancia y pertinencia de su información al objetivo de la investigación. De esta manera, se espera brindar al clínico las herramientas necesarias para responder adecuadamente frente a esta patología. MÉD.UIS.2020;33(2):75-84.

Abstract Disseminated Intravascular Coagulation is an altered state of coagulation secondary to local or systemic inflammatory symptoms. It is characterized by increased coagulation and inadequate endogenous fibrinolysis resulting in intravascular fibrin formation, multi-organ microvascular thrombosis, and excessive consumption of blood coagulation factors, this triggers severe bleeding and thrombosis, which lead to organic and circulatory failure as the main clinical manifestation.This article aims to review the state of the art describing its definition, etiology, pathophysiology, clinical manifestations and news in its diagnosis and treatment. Accordingly, a bibliographic search was carried out in PubMed using the MeSH term "Disseminated Intravascular Coagulation", selecting 63 articles for the relevance and pertinence of their information to the objective of the investigation. Therefore, it is expected to provide the clinician with the necessary tools to adequately respond to this pathology. MÉD.UIS.2020;33(2):75-84.

Thrombin generation and thromboelastometry tests in dogs with chronic kidney disease / Testes de geração de trombina e tromboelastometria em cães com doença renal crônica

Patients with chronic kidney disease (CKD) have paradoxical hemostatic potential because they have bleeding episodes but are also prone to thrombosis. Few studies have evaluated blood viscoelastic properties in dogs with kidney disease; on the other hand, hypercoagulability has been observed in these patients. It is also emphasized that the platelet function and its participation in this process have not yet been fully understood. The objective of this study was to evaluate and compare the Thrombin Generation Test (TGT) and also viscoelastic properties of the blood measured by thromboelastometry (TEM) in dogs with proteinuria in CKD. Twenty healthy dogs (Control Group) and 19 dogs with CKD in stage III or IV, classified according to International Renal Interest Society - IRIS, were selected, and the reference test of urine protein:creatinine ratio (UPCR) should be greater than one (CKD group). Blood samples for TEM, thrombin generation, Prothrombin Time (PT), activated Partial Thromboplastin Time (aPTT), and fibrinogen concentration was collected at a single time for both groups after inclusion criteria being confirmed. Statistical analysis was performed according to the distribution of variables at 5% significance level. Differences were observed between healthy dogs and those with proteinuria in CKD noted in TEM. The TGT was unable to differentiate between sick and healthy groups. However, when the nephropathy was stratified, increases in TTP and peak thrombin concentration by TGT were observed in females and dogs over 30 days of diagnosis of CKD. Both tests signaled a discrete state of hypercoagulability. In fact, TEM is more sensitive to detect hypercoagulability in dogs with CKD. However, the TGT has potential clinical application by allowing long-term sample storage.(AU)

Os pacientes com doença renal crônica (DRC) apresentam um potencial hemostático paradoxal, pois apresentam episódios de sangramento, mas também são propensos à trombose. Poucos estudos avaliaram as propriedades viscoelásticas sanguíneas em cães com doenças renais, entretanto, a hipercoagulabilidade já foi observada nestes pacientes. Ressalta-se ainda que a função plaquetária e sua participação neste processo ainda não foram totalmente esclarecidas. O objetivo foi avaliar e comparar o teste de geração de trombina (TGT) e as propriedades viscoelásticas sanguíneas medidas pela tromboelastometria (TEM) em cães com DRC proteinúrica. Foram selecionados 20 cães saudáveis (grupo controle) e 19 cães com DRC em estágios III ou IV classificados segundo o IRIS e a relação proteína/creatinina urinária maior que um (grupo DRC). As amostras de sangue para a realização da tromboelastometria (TEM), geração de trombina, tempo de protrombina (TP), tempo de tromboplastina parcial ativada (TTPA) e concentração de fibrinogênio foram colhidas em momento único para ambos os grupos após os critérios de inclusão confirmados. A análise estatística foi realizada de acordo com a distribuição das variáveis, ao nível de 5% de significância. Foi observada diferença entre os cães saudáveis e os com DRC proteinúrica observados na TEM. O teste de geração de trombina não foi capaz de diferenciar os grupos doente e saudável. Entretanto, quando os nefropatas foram analisados de forma estratificada, foram observados aumentos do ETP e da concentração máxima de trombina (peak) pelo TGT em fêmeas e em cães com mais de 30 dias de diagnóstico da DRC. Ambos os testes sinalizando para um discreto estado de hipercoagulabiliade. A tromboelastometria é mais sensível para detectar a hipercoagulabilidade em cães com DRC. Entretanto, o teste de geração de trombina tem melhor aplicabilidade por permitir o armazenamento da amostra em longo prazo.(AU)

Estudo da ação de inibidores peptídicos de enzimas trombina-símiles na coagulação sanguínea humana / Study of the action of thrombin-like enzymes peptides inhibitors in human blood coagulation

Ophidism is considered the most important cause of accidents by venomous animals around the world. Botropic venom is a highly complex mixture of proteins, peptides and enzymes that, when interacting with human proteins, triggers several local symptoms, such as edema, ecchymosis, pain, blisters and, in more severe cases, necrosis and limb amputation. It also causes systemic symptoms, such as blood incoagulability. The metalloproteases (SVMPs) and the serine proteases (SVSPs) are the major components of Bothrops jararaca venom and are correlated with local and systemic effects. The treatment for poisoning indicated by the Ministry of Health is the administration of botropic antivenom, which despite being highly effective, has certain limitations, such as the partial neutralization of SVSPs. Among the strategies that aim to improve the antivenom and, thus, the treatment of envenomation, is the search for selective inhibitors for SVSPs, which can act simultaneously to the antivenom. Considering the similarity of the catalytic triad between human serine proteases and SVSPs, and since inertia against human serine proteases is a prerequisite for the association of any molecule with antivenom, the present project aimed at the “Study of the action of thrombin-like enzymes peptide inhibitors in human blood coagulation”. The peptide inhibitors, selective for the inhibition of SVSPs, were designed based on a substrate hydrolyzed by these enzymes from Bothrops jararaca venom and showed different inhibition efficacy. In silico analyzes suggest that the inhibitors bound in regions distant from the catalytic triad (His, Asp and Ser) of batroxobin, a thrombin-like enzyme used as a model in studies of enzyme/peptide inhibitor interaction.

O ofidismo é considerado a causa mais importante de acidentes por animais peçonhentos em todo o mundo. O veneno botrópico é uma mistura altamente complexa de proteínas, peptídeos e enzimas que, quando interagem com as proteínas humanas, desencadeiam vários sintomas locais, como edema, equimose, dor, bolhas e, em casos mais graves, necrose e amputação do membro; e sistêmicos, como a incoagulabilidade sanguínea. As metaloproteinases (SVMPs) e as serinoproteinases (SVSPs) são os componentes majoritários do veneno de Bothrops jararaca e estão correlacionadas com os efeitos locais e sistêmicos. O tratamento para o envenenamento indicado pelo Ministério da Saúde é a administração do antiveneno botrópico, que apesar de ser altamente eficaz, apresenta certas limitações, como a parcial neutralização das SVSPs. Dentre as estratégias que visam à melhoria do antiveneno e, assim, o tratamento, está a pesquisa por inibidores seletivos de SVSPs, que possam atuar de forma sinérgica ao antiveneno. Considerando a similaridade da tríade catalítica entre serinoproteinases humanas e as SVSPs, e visto que a inércia contra serinoproteinases humanas é um pré-requisito para a associação de qualquer molécula ao antiveneno, o presente projeto objetivou o “Estudo da ação de inibidores peptídicos de enzimas trombina-símiles na coagulação sanguínea humana”. Os inibidores peptídicos, seletivos quanto à inibição de SVSPs, foram desenhados com base em substrato hidrolisado por estas enzimas do veneno de Bothrops jararaca, e apresentaram diferentes eficácias de inibição. Análises in silico sugerem que os inibidores se ligaram em regiões distantes da tríade catalítica (His, Asp e Ser) da batroxobina, uma enzima trombina-símile usada como modelo em estudos de interação da enzima/inibidor peptídico.

Hemorragia posparto: nuevas evidencias / Postpartum hemorrhage: new evidence

Introducción: la hemorragia posparto (HPP) es toda pérdida sanguínea mayor de 500 ml luego de un parto vaginal o mayor de 1000 mililitros luego de una cesárea, o cualquier pérdida sanguínea luego del parto que provoque inestabilidad hemodinámica, independiente del tipo de parto. Puede provocar signos y síntomas de choque que si no se maneja adecuadamente podría comprometer la vida de la paciente. Objetivo: realizar una revisión bibliográfica sobre HPP. Métodos: se realizó una exhaustiva revisión bibliográfica de la literatura médica más actualizada sobre HPP. Resultados y discusión: 32 artículos médicos en idioma español y en idioma inglés de los últimos años se incluyen en el presente trabajo, lo que incluye guías clínicas. La HPP se clasifica en hemorragia postparto primaria, temprana o inmediata y en hemorragia postparto secundaria o tardía. Dentro de las principales causas de hemorragia postparto primaria tenemos como nemotecnia las 4 T que incluyen: Tono, Trauma, Tejido y Trombina, siendo la más frecuente la relacionada con el tono que representa el 70% de los casos. La clave del manejo de la HPP es reconocer el sangrado excesivo en el posparto, identificar la causa, e iniciar una intervención adecuada según el caso. Conclusión: la HPP es la segunda causa de muerte materna a nivel mundial, por lo tanto, es muy importante conocer sus causas, manejo y la prevención de la misma.

Introduction: postpartum hemorrhage (PPH) is any blood loss greater than 500 ml after a vaginal birth or more than 1000 milliliters after a cesarean, or any blood loss after delivery that causes hemodynamic instability regardless of the type of delivery. It can cause signs and symptoms of shock, which if not properly handled could compromise the patient life. Objective: we performed an exhaustive review of the most recent medical literature about PPH. Methods: an exhaustive bibliographic review of the most recent medical literature on PHP was carried out. Results and discussion: 32 medical articles in Spanish and in English language of the last years were included in the present work including clinical guidelines. PPH is classified as primary, early or immediate postpartum hemorrhage and secondary or late postpartum hemorrhage. Among the main causes of primary postpartum hemorrhage, we have as mnemonic the 4 T that include: Tone, Trauma, Tissue and Thrombin, the most frequent being the one related to the tone that represents 70% of the cases. The key of the management is to recognize hemorrhage after the delivery, identify the cause and start an opportune and adequate treatment. Conclusion: PPH is the second cause of maternal death worldwide, therefore, it is very important to know its causes, management and prevention.

[Novel oral anticoagulants in non-valvular atrial fibrillation: How to improve its management in Spain]. / Anticoagulantes orales directos en la fibrilación auricular no valvular: cómo mejorar su uso en España.

INTRODUCTION AND OBJECTIVES: Recent real-world data studies on the use of direct oral anticoagulants (DOAC) in patients with non-valvular atrial fibrillation, provide data on the use of different DOAC according to patient characteristics. The objective of this work was to elaborate on the suggestions on the use of DOAC based on evidence and clinical experience. MATERIALS AND METHODS: A multidisciplinary panel of 8 experts developed the agreed content. The document was completed in 10 regional meetings with experts from different specialties. According to these contributions, the panel prepared the final suggestions. RESULTS: The final document includes the contributions generated throughout the entire process in 3 sections. The general conclusions / suggestions on the use of DOAC are detailed. Specific tips on the use of each DOAC are proposed, based on the specific clinical profiles of the patients. Finally, the limitations on the use of DOAC are defined, and a group of actions are proposed to improve the management of anticoagulation. CONCLUSIONS: It is necessary to overcome the clinical and administrative barriers that hinder the optimal use of DOAC, in order to improve the treatment of patients with non-valvular atrial fibrillation who require anticoagulation.

Extraction, physical-chemical characterization and in vitro inhibitorypotential of thrombin generation of crude sulfated polysaccharides from Brazilian tropical seaweeds / Extração, caracterização físico-química e potencial inibitório in vitro da geração detrombina de polissacarídeos sulfatados brutos de algas marinhas tropicais brasileiras

The biotechnological value of macroalgae for screening assays of thrombin generation-TG using sulfated polysaccharides-SPs as substitutes to heparin has been poorly explored. Five Brazilian species of macroalgae (Gracilaria birdiae, Acanthophora muscoides, Halymenia sp., Caulerpa cupressoides and C. racemosa) wereanalyzed and compared for their abundance, physical-chemical characteristics and in vitro anticoagulant assays of activated partial thromboplastin time-APTT, prothrombin time-PT and TG. Papain extraction yielded (p 100 kDa. These procedures,combined with the use of Stains-All, also indicated nonSPs. APTTs ranged from 2.81 (A. muscoides) to 21.30 IU(Halymenia sp.) vs. heparin (193 IU), and were dependent on sulfation of the crude SPs. PT was not altered. Withrespect to TG assay, crude SPs modified concentration-dependent and independently from molecular mass TGby both intrinsic/extrinsic pathways in 60-fold diluted human plasma, with total intrinsic inactivation using crudeSPs from A. muscoides in parallel to heparin (p < 0.05). Thrombosis in vitro is differentially modulated by distinctcrude SPs from Brazilian seaweeds.

O valor biotecnológico das macroalgas para ensaios de varredura de geração de trombina-GT pouco tem sido explorado usando polissacarídeos sulfatados-PSs como substitutos à heparina. Foramanalisadas e comparadas cinco espécies brasileiras de macroalgas (Gracilaria birdiae, Acanthophora muscoides, Halymenia sp., Caulerpa cupressoides e C. racemosa) quanto à abundância, às característicasfísico-químicas e os ensaios anticoagulantes in vitro de tempo de tromboplastina parcial ativada-TTPA, aotempo de protrombina-TP e a GT. A extração com papaína rendeu (p 100 kDa. Esses procedimentos,combinados ao uso de azul de toluidina/Stains-All, indicaram também polissacarídeos-não sulfatados. OsTTPAs foram dependentes da sulfatação dos PSs brutos e variaram de 2,81 (A. muscoides) a 21,30 UI (Halymenia sp.) vs. heparina (193 UI). O TP não foi alterado. Com respeito ao ensaio de GT, os PSs brutos modificaram, dependente de concentração e independentemente de massa molecular, GT pelas viasintrínseca/extrínseca no plasma humano diluído 60 vezes, com inativação intrínseca total usando PSs brutosde A. muscoides em paralelo à heparina (p < 0,05). A trombose in vitro é modulada diferencialmente porPSs brutos distintos de algas marinhas brasileiras.

Tratamiento del seudoaneurisma femoral mediante la inyección local de trombina / Femoral Pseudoaneurysm Treatment by Local Thrombin Injection

Introducción: El seudoaneurisma es una complicación ocasional (0,05-0,5%) de los procedimientos intervencionistas cuando se utiliza el acceso femoral. El cierre con inyección local de trombina como alternativa al tratamiento quirúrgico luego de compresión manual fallida cuenta con escasos registros. Objetivo: Evaluar la seguridad y eficacia del cierre del seudoaneurisma femoral iatrogénico mediante la inyección local de trombina guiada por ecografía Doppler. Material y métodos: Entre marzo de 2007 y junio de 2016 se incluyeron 32 pacientes para tratamiento con inyección de trombina. Resultados: La edad media fue de 64,3 ± 10,2 años. La mayoría de los seudoaneurismas estuvieron asociados con la realización de cateterismos coronarios diagnósticos o terapéuticos (59,3%). Siete pacientes habían recibido tratamiento anticoagulante y 21 doble antiagregación plaquetaria. En todos los casos se intentó previamente el cierre por compresión manual. La media del diámetro mayor de los seudoaneurismas fue de 38 mm. Luego del tratamiento, la trombosis inmediata del saco ocurrió en 28 pacientes (87,5%), mientras que 4 pacientes requirieron una segunda inyección, lo que determinó un éxito del 96,8%. En un solo paciente este tratamiento no fue efectivo, con posterior conversión a reparación quirúrgica programada. La dosis media de trombina fue de 450 unidades. Un único paciente presentó complicación trombótica venosa que requirió terapia anticoagulante, con buena evolución clínica. Conclusión: El tratamiento del seudoaneurisma con inyección local de trombina guiada con eco-Doppler fue una alternativa terapéutica segura y eficaz para pacientes con seudoaneurisma femoral refractarios a la compresión manual.

Background: Pseudoaneurysm is a rare complication (0.05-0.5%) after interventional procedures using femoral access. There are few registries of local thrombin injection for pseudoaneurysm closure as an alternative treatment to surgery after failed manual compression. Objective: The aim of this study was to evaluate the safety and efficacy of iatrogenic femoral pseudoaneurysm closure with Doppler ultrasound-guided local thrombin injection. Methods: Thirty-two patients were included for thrombin injection treatment between March 2007 and June 2016. Results: Mean age was 64.3±10.2 years. Most pseudoaneurysms were associated with diagnostic or therapeutic cardiac cath-eterizations (59.3%). Seven patients had received anticoagulant treatment and 21, double antiplatelet therapy. In all cases, prior closure was attempted by manual compression. Mean pseudoaneurysm major diameter was 38 mm. Following treatment, immediate pseudoaneurysm sac thrombosis occurred in 28 patients (87.5%), while 4 patients required a second injection, resulting in 96.8% success rate. Treatment was not effective in only one patient, with subsequent conversion to programmed surgical repair. Mean thrombin dose was 450 units. Only one patient presented with venous thrombosis complication requir-ing anticoagulant therapy, with good clinical outcome. Conclusion: Doppler ultrasound-guided local thrombin injection was a safe and effective therapeutic alternative for pseudoa-neurysm treatment in patients with femoral pseudoaneurysm refractory to manual compression.

An anti-dengue and anti-herpetic polysulfated fraction isolated from the coenocytic green seaweed Caulerpa cupressoides inhibits thrombin generation in vitro / Uma fração polissulfatada anti- dengue e anti- herpética isolada da alga marinha verde cenocítica Caulerpa cupressoides inibe geração de trombina in vitro

The antiviral potency of Caulerpa cupressoides (Chlorophyta) sulfated polysaccharidic fractions (Cc -SP1→3) associated with thrombin generation (TG) assay is unknown. This study analyzed the structure of Cc-SP1 and its effects against herpes viruses (HSV-1 and HSV-2), dengue-virus (DENV-1) , human-metapneumovirus (HMPV) and adenovirus (AdV) in Vero and mosquito C6/36 cell-lines and as inhibitor of TG in 60- fold diluted human plasma using continuous system. Infrared analysis indicated ulvan containing 11% sulfate, 40.16% total sugars and 6% uronic acid. Procedures of agarose/polyacrylamide gels electrophoresis revealed two major components presenting sulfate and non SPs, with molecular dispersion ranging from 8 to > 100 kDa, respectively, as confirmed by gel permeation chromatography. Cc-SP1 did not cause cytotoxicity up to 1000 µg mL-1 and was more effective inhibitor of DENV-1 (96%, 0.35 µg mL-1) compared with HSV-1 (90%, 27 µg mL- 1) and HSV-2 (99.9%, 0.9 µg mL-1) in Vero cell-line, whose selectivity indexes were > 714, > 9.2 and > 131, respectively, but was inactive against HMPV, AdV and C6/36 cell-line using plate reduction assay. Cc-SP1 required concentration 20.8-fold higher of SPs than heparin for abolishes intrinsically TG, but at concentrations so far the anti-HSV-1. Therefore, TG assay provides data to guide studies of Cc-SP1 on anticoagulant/antiviral effects.

A potência antiviral de frações polissacarídicas sulfatadas de Caulerpa cupressoides (Chlorophyta) (Cc-PS1→3) é desconhecida e associada com ensaio de geração de trombina (GT). Analisaram-se de Cc-PS1 estrutura e efeitos contra herpesviroses (HSV-1 e HSV-2), vírus da dengue (DENV-1), metapneumovírus-humano (MPVH) e adenovírus (AdV) em linhagens de células Vero e de mosquito C6/36 e como inibidora de GT em plasma humano diluído 60 vezes usando sistema contínuo. Análise de infravermelho indicou 'ulvana' contendo sulfato (11%), açúcares totais (40,16%) e ácido urônico (6%). Procedimentos de electroforese em géis de agarose/poliacrilamida revelaram dois componentes majoritários apresentando sulfato e polissacarídeos não sulfatados, com dispersão molecular variando de 8 a > 100kDa, respectivamente, confirmada por cromatografia de permeação em gel. Cc-PS1 não causou citotoxicidade até 1000 µg mL-1 e se mostrou, em linhagem de célula Vero usando ensaio de redução de placas, inibidora efetiva de DENV-1 (96%; 0,35 µg mL-1) comparada com HSV-1 (90%; 27 µg mL-1) e HSV-2 (99,9%; 0,9 µg mL-1), cujos índices de seletividade foram > 714; > 9,2 e > 278, respectivamente, enquanto, demonstrou-se ineficaz sobre HMPV, AdV e linhagem de célula C6/36. Foi requerida concentração 20,8 vezes maior de Cc-PS1 que heparina para abolir GT intrinsicamente, mas em concentrações diferentes da anti-HSV-1. Portanto, ensaio de GT fornece dados para estudos direcionados sobre efeitos anticoagulante/antiviral de Cc-PS1.

Reduced thrombin activatable fibrinolysis inhibitor and enhanced proinflammatory cytokines in acute coronary syndrome.

OBJECTIVE: A study was made of the changes in the serum levels of thrombin activatable fibrinolysis inhibitor (TAFI), proinflammatory cytokines and acute phase proteins in the acute stage of acute coronary syndrome (ACS), in order to explore the possibility of using TAFI as a biomarker for ACS risk assessment. METHODS: A total of 211 patients with ACS were enrolled, and healthy subjects were used as controls. Blood samples were taken within 24h after admission. Serum TAFI levels were determined by immunoturbidimetry. Serum levels of interleukin-1ß (IL-1ß), interleukin-6 (IL-6) and tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) were determined by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). Procalcitonin (PCT) and C-reactive protein (CRP) levels were measured by gold-immunochromatographic assay. RESULTS: Serum TAFI levels in ACS patients were significantly decreased versus the controls. The IL-1ß, IL-6, TNF-α, PCT and CRP levels were markedly higher in the ACS patients than in the controls. Correlation analysis revealed a strong negative correlation between TAFI concentration and the IL-1ß, IL-6, TNF-а, PCT and CRP levels in ACS patients and in controls. Multivariate logistic regression analysis suggested decreased serum TAFI to be an independent risk factor for ACS (OR 9.459; 95% CI 2.306-38.793; P=0.002). The area under the receiver operating characteristic (ROC) curve for TAFI was 0.872 (95% CI 0.787-0.909; P<0.001). The optimum TAFI cutoff point for the prediction of ACS was 24µg/ml, with a sensitivity of 75.83% and a specificity of 72.57%. CONCLUSION: These findings suggest that TAFI can be useful as a potential biomarker for ACS risk assessment.

Dabigatran en plasma: tiempos de trombina diluido, Ecarin y veneno de víbora de Russell diluido / Plasma dabigatran: diluted thrombin time, Ecarin and diluted Russell Viper Venom Time / Dabigatrana em plasma: tempos de trombina diluído, Ecarin e veneno de víbora de Russell diluído

Los objetivos del trabajo fueron verificar la calidad analítica del ensayo tiempo de trombina diluido (DTI) para medición de la concentración plasmática (cc) de dabigatran comparando dos coagulómetros de detección foto-óptica, comparar los resultados con el tiempo de Ecarin (ECT) y correlacionar las cc con las pruebas básicas de coagulación Tiempo de protrombina (TP), APTT y Tiempo de trombina (TT), y tiempo de veneno de víbora de Russell con fosfolípidos concentrados (DRVVTC). Se tomaron 43 muestras de plasma en el valle (10-14 h de la última toma) de 40 pacientes que recibían dabigatran. DTI y ECT presentaron (%) repetitividad <5,4% y <7,5%, CV interensayo <6% y <9%, respectivamente, en el protocolo EP15A2, aceptables para un Error Total permitido (TEa) <15%. Las cc medidas en pacientes fueron: mediana 83 (4-945) ng/mL. La comparación de equipos ACL TOP 300 y 500 dio resultados equivalentes por procedimiento alternativo de comparación de métodos. La comparación ECT vs. DTI fue satisfactoria por regresión de Deming (pendiente 1,143, ordenada al origen -19,33). Las correlaciones de cc vs. APTT, TP y DRVVTC fueron moderadas y no lineales tendiendo a plateau a cc>350 ng/mL, r2 0,59, 0,66 y 0,59, respectivamente. El TT fue extremadamente sensible: >120 s a cc 50 ng/mL. DTI presentó un buen desempeño analítico y permitió cuantificar dabigatran plasmático a cc bajas y altas en ambos equipos utilizados. ECT presentó resultados comparables a DTI. Se verifica una correlación moderada entre cc de dabigatran y las pruebas clásicas y DRVVTC, pudiendo ser estimadores de cc a partir de los 50 ng/mL.

The aims of the study were to verify the analytical performance of Dilute Thrombin Time (DTI) test to measure plasma dabigatran concentration (cc) in two photo-optical coagulometers, compare Ecarin clotting Time (ECT) and DTI results, and correlate cc with classical coagulation tests: prothrombin time (PT), APTT, thrombin time (TT) and diluted Russell Viper Venom Time tests with high phospholipid concentration (DRVVTC). Forty three plasma samples from 40 patients taking dabigatran were drown at through (10-14 hs.since last dose). DTI and ECT showed repetitivity (%) <5.4% and <7.5%, interassay CV <6% and <9%, respectively, following EP15A2 protocol, acceptable considering a Allowed Total Error (TEa)<15%. Patients` cc: median 83 (4-945) ng/mL. The comparison between ACL TOP 300 and 500 coagulometers showed equivalent results by using the alternative method comparison test. ECT vs. DTI: acceptable by Deming`s regression (slope 1.143, Y insert -19.33). cc vs. APTT, TP and DRVVTC: nonlinear and moderate correlations with plateau reached at cc >350 ng/mL, r2 0.59, 0.66 y 0.59, respectively. TT is extremely prolonged at cc >50 ng/mL. In conclusion: DTI showed a good analytical performance in both coagulometers. ECT showed comparable results to DTI. We verified that dabigatran cc presented moderate correlations with PT, APTT and DRVVTC, and that these tests could only qualitative estimate cc >50 ng/mL.

Os objetivos do trabalho foram verificar a qualidade analítica do ensaio tempo de trombina diluído (DTI) para medição da concentração plasmática (cc) de dabigatrana, comparando dois coagulômetros de detecção foto-óptica, comparar os resultados com o tempo de Ecarina (ECT) e correlacionar as cc com os testes básicos de coagulação Tempo de protrombina (TP), APTT e Tempo de trombina (TT), e tempo de veneno de víbora de Russell com fosfolipídios concentrados (DRVVTC). Foram tomadas 43 amostras de plasma no vale (10-14 h. da última toma) de 40 pacientes que recebiam dabigatrana. DTI e ECT apresentaram (%) repetitividade <5,4% e <7,5%, CV interensaio <6% e <9%, respectivamente, no protocolo EP15A2, aceitáveis para um Erro Total permitido (TEa) <15%. Cc medidas em pacientes: mediana 83 (4-945) ng/mL. Comparação de equipamentos ACL TOP 300 e 500: resultados equivalentes por procedimento alternativo de comparação de métodos. Comparação ECT vs. DTI: satisfatória por regressão de Deming (pendente 1,143, ordenada à origem -19,33). Correlações cc vs. APTT, TP e DRVVTC: moderadas e não lineares tendendo a plateau a cc>350 ng/mL, r2 0,59; 0,66 e 0,59, respectivamente. O TT é extremamente sensível: >120 s a cc 50 ng/mL. DTI apresentou um bom desempenho analítico e permitiu quantificar dabigatrana plasmática a cc baixas e altas em ambos os equipamentos utilizados. ECT apresentou resultados comparáveis com DTI. Verifica-se uma correlação moderada entre cc de dabigatrana e os testes clássicos e DRVVTC, podendo ser estimadores de cc a partir dos 50 ng/mL.

The collagen, fibrinogen and thrombin biological adhesive is effective in treating experimental liver injuries / O adesivo biológico de colágeno, fibrinogênio e trombina é eficaz no tratamento de lesões hepáticas experimentais

ABSTRACT Objective: to evaluate the effectiveness of an collagen-based adhesive associated with fibrinogen and thrombin in experimental liver injuries in rats. Methods: we randomly divided 30 Wistar rats into three groups: A, B and C. All underwent a standard liver traumatic injury. In group A, the lesion was treated with the adhesive; in group B, with conventional, absorbable suture; group C received no treatment. We analyzed the time of hemostasis, mortality, occurrence of adhesions and any histological changes. Results: there was no statistical difference in relation to mortality (p=0.5820). The adhesive treated group showed the lowest hemostasis times (p=0.0573, odds ratio 13.5) and lower incidence of adhesions (p=0.0119). The histological alterations of the Groups A and B were similar, with foreign body granuloma formation separating the adhesive material and the hepatic stroma suture. Conclusion: the collagen adhesive associated with fibrinogen and thrombin was effective in treating experimental hepatic injury, providing a lower incidence of adhesions between the liver and surrounding structures.

RESUMO Objetivo: avaliar a eficácia de um adesivo a base de colágeno associado ao fibrinogênio e trombina, no trauma hepático experimental em ratos. Métodos: toram incluídos no estudo 30 ratos Wistar, igualmente divididos aleatoriamente em três grupos: A, B e C. Todos foram submetidos à lesão traumática hepática padronizada. No grupo A, a lesão foi tratada com o adesivo, no grupo B, com sutura convencional com fio absorvível, e no grupo C, não houve tratamento da lesão. Foram analisados o tempo de hemostasia, mortalidade, ocorrência de aderências e eventuais alterações histológicas. Resultados: os resultados mostraram que não houve diferença estatística em relação à mortalidade (p=0,5820). O grupo tratado com adesivo apresentou os menores tempos de hemostasia (p=0,0573 e odds ratio 13,5) e menor ocorrência de aderências (p=0,0119). Microscopicamente as alterações histológicas dos grupos A e B foram semelhantes, com a formação de granuloma de corpo estranho separando o material do adesivo e do fio de sutura do estroma hepático. Conclusão: o adesivo de colágeno associado ao fibrinogênio e trombina foi eficaz no tratamento do trauma hepático experimental, proporcionado menor ocorrência de aderências entre o fígado e as estruturas vizinhas.

Mild-acid hydrolysis of a native polysulfated fraction from Acanthophora muscoides generates sulfated oligosaccharides displaying in vitro thrombin generation inhibition / Hidrólise ácida branda de uma fração polissulfatada de Acanthophora muscoides gera oligossacarídeos sulfatados mostrando inibição de geração de trombina in vitro

A. muscoides (Rhodophyta) has three polysulfated fractions (-1, -2 and Am-3). Am-2 displayed anti -inflammation and serpin-independent anticoagulation effects; however, no effect of oligomers on thrombin-generation (TG) has been demonstrated. This study employed mild-acid hydrolysis to obtain low-molecular-size derivatives from Am-2 and compared in vitro inhibitory effects between intact Am-2 and its hydrolysates on a TG assay. The polysaccharidic extract was fractionated by DEAE-cellulose that revealed Am-2 eluted with 0.75-M NaCl containing sulfate (23%), hexoses (51%) and absence of proteins, and indicating, by one-dimension nuclear magnetic resonance, structure of galactan similar to that of the extract. The depolymerization with HCl (0.02 or 0.04-M, 60°C) for different times progressively reduced the charge density and the molecular-size of Am-2 based on electrophoresis in agarose and polyacrylamide gels, respectively, where at higher acid concentration and critical time up to 5h yielded fragment of Ì´14-kDa similar to that of unfractionated heparin (UHEP). Regarding the TG assay, intact Am-2 inhibited concentration- dependent intrinsic pathway, whereas its hydrolysates abolished it like UHEP, except the analog fragment (92.87% inhibition), when in 60-fold diluted human plasma using chromogenic method in a continuous system. The results reveal an alternative approach for the production of oligosaccharides from A. muscoides with TG inhibition.

A rodofícea A. muscoides possui três frações polissulfatadas (-1, -2 e Am-3). Am-2 mostrou efeito anti-inflamação e anticoagulação independente de serpina. Entretanto, não se demonstrou efeito de oligômeros sobre ensaio de geração de trombina (GT) . Este estudo empregou hidrólise ácida branda para obter derivados de tamanho molecular baixo de Am -2 e os efeitos inibitórios in vitro entre Am-2 intacta e hidrolisados comparados sobre um ensaio de GT. O extrato polissacarídico, fracionado por DEAE-celulose, revelou Am-2 eluída com NaCl-0,75M contendo sulfato (23%), hexoses (51%) e destituída de proteínas. E, ainda, por ressonância magnética nuclear-unidimensional, indicando galactana semelhante a do extrato. A depolimerização com HCl (0,02 ou 0,04-M; 60°C) reduziu, progressivamente durante tempos diferentes, a densidade de carga e o tamanho molecular de Am-2 baseada nas eletroforeses em géis de agarose e de poliacrilamida, respectivamente, em que, concentração ácida elevada e tempo crítico de até 5h renderam fragmento de Ì´14-kDa semelhante ao da heparina não fracionada (HEPNF). Já no ensaio de GT, Am-2 intacta, quando em plasma humano diluído 60 vezes, usando método cromogênico por meio de sistema contínuo, quem inibiu a via intrínseca dependente de concentração, ao passo que seus hidrolisados aboliram como HEPNF, exceto fragmento análogo (inibição 92,87%). Os resultados revelam uma abordagem alternativa para produzir oligossacarídeos de A. muscoides com inibição de GT.

Generalidades del sistema de la coagulación y pruebas para su estudio / Overwiew of the Coagulation System and laboratory tests for its study

En la década de los años sesenta, se describió la cascada de la coagulación como una secuencia de eventos enzimáticos iniciada por dos vías, la intrínseca y la extrínseca, las cuales convergían en una vía común para generar una enzima multifuncional, denominada trombina. La principal función de esta enzima consistía en transformar el fibrinógeno, en fibrina, una proteína que se polimeriza espontáneamente para formar la base estructural del coágulo. Posteriormente, se propuso el Modelo Celular según el cual la coagulación no es la consecuencia de vías de activación enzimáticas secuenciales, sino de una red de interacciones entre proteínas plasmáticas y transmembranas, así como, varios tipos celulares, que permiten la formación de complejos enzimáticos altamente eficientes con la finalidad de generar trombina. Esta revisión explica en detalle ambos enfoques, además, aborda las diferentes funciones que cumple la trombina dentro de la hemostasia y los mecanismos de inhibición que regulan la coagulación. Finalmente, se describen diferentes pruebas empleadas en la actualidad para evaluar la funcionalidad del sistema de coagulación, como: el tiempo de tromboplastina parcial activado, el tiempo de protrombina, el tiempo de trombina, el tiempo de reptilasa, el tiempo de coagulación por ecarina y el uso de sustratos cromogénicos para evaluar cada factor de la coagulación. Finalmente, dado a que la generación de trombina es clave dentro de la coagulación y a que el potencial de generar trombina puede indicar propensión a desarrollar eventos trombóticos o hemorrágicos, en este trabajo se presentan los métodos existentes para determinar la generación de trombina.

In the sixties, the clotting cascade was proposed, which describes the coagulation process as a sequence of enzymatic events initiated by two different pathways, the intrinsic and the extrinsic pathways, converging on a common pathway, to generate a multifunctional enzyme, thrombin, whose main function is to convert fibrinogen into fibrin, a protein that polymerizes spontaneously to form the building block of a hemostatic clot. Later, it was proposed a cell-based model of the hemostasis according to that coagulation does not occur as a consequence of linear sequential enzyme activation pathways, but rather via a network of simultaneous interactions between plasmatic and transmembrane proteins, as well as several cellular types, that allow the formation of highly efficient enzymatic complexes that lead to thrombin generation. In this review, we summarize these two approaches highlighting the functions of thrombin within the hemostasis and the inhibition mechanisms that regulate the blood coagulation. Moreover, we described different tests that are used to assess the function of the coagulation system, such as: activated partial thromboplastin time, prothrombin time, thrombin time, reptilase time, ecarin clotting time, and the use of chromogenic substrates to evaluate individual coagulation factors. Finally, because of thrombin generation is a fundamental part of the blood coagulation and, an estimation of how well a particular individual can generate thrombin may correlate with either a risk of bleeding or thrombosis, we also include the existing methods to evaluate the potential of thrombin generation in an individual.

[Biomolecular markers in cancer-associated thromboembolism]. / Marcadores biomoleculares en la tromboembolia asociada al cáncer.

Patients with cancer have an increased risk of developing thromboembolism, which is associated with increased morbidity and mortality and hinders its clinical management. Cancer generates a hypercoagulable state that increases the generation of thrombin. This coagulation activation, along with the inflammatory changes fostered by the neoplastic cells, favors tumor progression at the local and distal level. In this review, we present the most salient aspects of the pathophysiology of hypercoagulability in cancer and list the hemostatic biomarkers that reflect this biological situation of hypercoagulability. These parameters can be used as risk factors to predict the probability of developing thrombosis, which help identify patients who can benefit from antithrombotic prophylaxis.